篇一：微生物实验报告：水中细菌总数和大肠菌群的检测
实验六 水中细菌总数和大肠菌群的检测
摘 要：本实验以测定公园河流水的细菌总数和大肠菌群的数量，来测定特定地点的水质情况。初步介绍了一种通用的方法来检测水源的健康指标，判定水体的质量。对该实验点的水源作出了定性的评价，以及关于试验中如何提高梯度重复的精度的分析。 关键字：河流水；细菌总数测定；大肠菌群；EMB培养 前言
各种天然水中常含有一定数量的微生物。水中细菌总数往往同水体受有机污染程度呈正相关，因而是评价水质污染程度的重要指标之一。细菌总数是指1mL水样中所含细菌菌落的总数[cfu/g(mL)]，可用稀释平板计数法检测。水中大肠菌群的数量可用来判断水源是否被粪便污染，并可间接推测水源受肠道病原菌污染的可能。
特征：G-无芽孢杆菌，兼性厌氧、在37℃24h内能发酵乳糖产酸、产气。 多管发酵法
初发酵：适当稀释样品，乳糖发酵培养，产酸产气；
分离培养：伊红美蓝（EMB）平板上划线分离，出现紫色、粉红色特征性菌落； 复发酵验证：挑取特征性菌落进行乳酸复发酵验证。
材料和方法
牛肉膏蛋白胨琼脂培养基：用于水中细菌总数测定
牛肉膏5g，蛋白胨10g， NaCl 5.0 g，琼脂8g， 蒸馏水1000ml； pH 7.0 乳糖胆盐蛋白胨培养基：用于初发酵
1×：蛋白胨 20g、牛胆盐 5g、乳糖 10g、0.04%溴甲酚紫水溶液 25mL（调pH值后加）、水 1000mL、pH 7.2－7.4 三倍浓缩液（3×）：除水以外，其余成分取三倍用量
分装：1×的培养基分装9ml/管， 3×的培养基分装5ml/管或50ml/瓶，均装上德汉氏小管。 灭菌条件：115℃ ，15min。
EMB培养基：用于大肠菌群菌落鉴定
脱水培养基，按说明书操作，水用量为90%。 水源：紫竹院河水
仪器： 高压灭菌锅、无菌培养皿、试管、吸管、接种环 、德汉氏小管、温箱、载玻片、酒精灯、显微镜等。
试剂 ： 牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂粉，伊红美兰琼脂培养基、水、乳糖、0.04%溴甲酚紫水溶液、胆盐、革蓝氏染色试剂
具体实验步骤： 1），相关器械的灭菌操作，以及前往紫竹院取少量的样品水。 2），按照上述的配料，无菌操作配置培养基。
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3），细菌总数的测定：取上述样品水，一次稀释10,10,10,3个浓度。对于每个浓度，取1ml稀释液加入冷却好的牛肉膏蛋白胨培养基中，立即混匀，每个浓度重复一次。将平皿倒置培养在37℃的温箱24h，计算平皿的细菌总数。
4），大肠菌群的测定：将样品水稀释成10,10,10,3个梯度。
实验结果与数据分析 1，细菌菌落总数
稀释浓度及菌落数
组别 1 2 平均
10 12 4 8
0-1-2
10 0 0 0
10 0 0 0
平板菌落状况 报告方式选取 最低稀释度下菌落数 × 稀释倍数
菌落总数（cfug , cfu/ml
均小于30
8.0×10
2,大肠菌群总数
实验结果 产酸 产气 紫黑色
EMB
粉红色
革兰-G 氏染
色
结论 阳性管数 初发酵
+ + +
原溶液 + + + + + +
+ + +
+ + +
+ + + +
+
+
+ + +
5
+
- 0
10
10
ck - - - - -
3，EMB 数据值计算 查表可得，MPN=MPN指数
10ml
接种量最大的一管的水样ml
接种量最大的管：1ml
每100ml水样中菌数最大可能值：230
95%可信限值 上限：700 下限：70 水样的分析得出这样的结果：细菌总数：80个/mL
大肠菌群数：2300个/L
大肠菌群数占细菌总数：2.88%。
根据我国《生活饮用水卫生标准》GB5749-85规定 细菌总数不超过100个，已达标。
大肠菌群不得超过1000个，超标。
经过严格的消毒处理，大肠杆菌不超过10000个，水样达标。
结论：从上述的水样分析，我们可以得出此处的河流水污染不是很严重，作为景观水，已经达到了标准，但是此类水是不能作为饮用水的，可能存在一些粪便的污染，导致大肠菌群的数量过高，倘若经过严格的消毒灭菌，才能饮用。
实验讨论：
1， 大肠菌群的定义是什么？、为什么要选择大肠菌群作为水源被肠道病原菌污染的指示菌？
大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。而由于大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。大量的调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，而且人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。所以大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。
2，EMB培养基含有哪几种主要成分？在检查大肠菌群时，各起什么作用？
EMB培养基主要包含以下几种物质：蛋白胨，乳糖，蔗糖，磷酸二氢钾，伊红Y，美蓝，蒸馏水。EMB培养基的机制就是靠微生物在发酵过程中，使培养基发生分解，产生大量的氢离子，从而改变培养基的PH，由于提前添加的指示剂，在PH值的改变下，就会发生颜色的变化，从而鉴定生长的菌种。在检测大肠菌群的时候，蛋白胨提供了氮源，磷酸二氢钾提供了磷元素和钾元素，
实验应注意的问题以及改进： 1，样品的问题
由于本实验是一个检测的实验，存在一个严格灭菌的过程。从采样，到最后的分析，整个过程不仅不能让其他杂菌污染，而且还得保证样品中本身细菌的总数基本不损失。 1），采样的器械必须是经过严格灭菌的，而且其本身的构造不会对微生物的生存造成威胁。 2），由于样品会处于密闭的过程，水中的含氧量会慢慢降低，所以对样品的处理应该尽快处理。 3），对于样品的稀释不应该用蒸馏水，而应该用灭菌的生理盐水，防止细菌吸水裂解死亡。 4），整个接种的操作必须正确，不能杀死细菌，或者引入其他杂菌。 2，关于梯度重复的问题
本实验设计到一个很关键的问题，那就是梯度重复。对于一个梯度的实验量的统计和处理，我们常常采用重复，来解决其实验误差所造成的影响，但有些时候重复增加了大量的工作量，却没有根本提高实验的准确性，仅以本实验为例。在对细菌数量测定时候，我们每
个梯度设置了2个重复，在事实上，第一个梯度的准确性很高，但是在最后一个梯度，可能存在很大的误差。在对一个样品进行定量分析的时候，我们往往要考虑很多干扰它的因数。假定我们所取的样品现在要进行一个梯度的稀释后取样，当前浓度为c，取样的体积为v，那么假定单位体积内只存在一个细菌，则可以建立如下的数学模型：
w=
∑x
n
i
-x
nx
ai
x=cv,
xi-x=aip,ai≤p=
kcvcv
cv]
?k?a?∑i ?
vc?n?从模型中，我们可以得到最终的表达式：w=,ai≤nvc
ai
(vc])，当取样体
积和梯度恒定的时候，我们不难发现，增大取样的重复数，可以提高实验的精确度，但是当c足够大的时候，分子本身就会变得无限小，而分母的一次增量远不如多次的。同理，当c很小的时候，分子变得很大，分母变得很小，这个时候不增加次数，或者调解取样体积，会造成很高的实验误差，所以，本实验的三个精度变量就是梯度，取样体积，梯度重复数。鉴于对本实验的最后分析，我们觉得，在后两个梯度有必要增加重复数，虽然增加了工作量，但是可以有效避免较大的实验误差带来的干扰。同样，在对其他的实验样品处理过程中，原始浓度一般只需要2个重复，随着数量级的增加，其重复的次数也应该发生变化，不应该不
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变，诸如在在10，设置4个重复，而10时候，可以设置8个重复，这样可以在追求最简工作量的时候，获得最简的实验结果。
参考文献：
[1] 王玉兰. 环境微生物学实验方法与技术.北京，化学工业出版社. 2009,3. [2] 陈坚. 环境微生物实验技术. 北京：化学工业出版社，2008
[3] 钱存柔. 微生物学实验教程（第二版）.北京：北京大学出版社，2008 [4] 周德庆. 微生物学教程（第二版）. 北京：高等教育出版社，2002,5. [5] 沈萍. 微生物学. 北京：高等教育出版社，2000.
[6] 徐全智，杨晋浩. 数学建模（第二版）. 北京：高等教育出版社，2008.
篇二：细菌培养实验报告
篇一：培养基的制备与灭菌实验报告
陕西师范大学远程教育学院
生物学实验报告
报告题目培养基的制备与灭菌
姓 名 刘 伟
学 号
专 业 生 物 科 学
批次/层次
指导教师
学习中心培养基的制备与灭菌
一、目的要求
1. 掌握微生物实验室常用玻璃器皿的清洗及包扎方法。
2. 掌握培养基的配置原则和方法。
3. 掌握高压蒸汽灭菌的操作方法和注意事项。
二、基本原理
牛肉膏蛋白胨培养基：
是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供细菌生长繁殖之用。 高压蒸汽灭菌：
主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。将灭菌的物品放在一个密闭和加压的灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅内水沸腾而产生蒸汽。待蒸汽将锅内冷空气从排气阀中趋尽，关闭排气阀继续加热。此时蒸汽不溢出，压力增大，沸点升高，获得高于100℃的温度导致菌体蛋白凝固变性，而达到灭菌的目的。
三、实验材料
1. 药品：牛肉膏、蛋白胨、nacl、琼脂、1mol/l的naoh和hcl溶液。
2. 仪器及玻璃器皿：天平、高压蒸汽灭菌锅、移液管、试管、烧杯、量筒、三
角瓶、培养皿、玻璃漏斗等。
3. 其他物品：药匙、称量纸、ph试纸、记号笔、棉花等。
四、操作步骤
（一）玻璃器皿的洗涤和包装
1．玻璃器皿的洗涤
玻璃器皿在使用前必须洗刷干净。将三角瓶、试管、培养皿、量筒等浸入含有洗涤剂的水中．用毛刷刷洗，然后用自来水及蒸馏水冲净。移液管先用含有洗涤剂的水浸泡，再用自来水及蒸馏水冲洗。洗刷干净的玻璃器皿置于烘箱中烘干后备用。
2．灭菌前玻璃器皿的包装
（1） 培养皿的包扎：培养皿由一盖一底组成一套，可用报纸将几套培养皿包
成一包，或者将几套培养皿直接置于特制的铁皮圆筒内，加盖灭菌。包装后的培养皿须经灭菌之后才能使用。
（2） 移液管的包扎：在移液管的上端塞入一小段棉花(勿用脱脂棉)，它的作
用是避免外界及口中杂菌进入管内，并防止菌液等吸入口中。塞入此小段棉花应距管口约0.5cm左右，棉花自身长度约1~1.5cm。塞棉花时．可用一外围拉直的曲别针、将少许棉花塞入管口内。棉花要塞得松紧适宜，吹时以能通气而又不使棉花滑下为准。
先将报纸裁成宽约5cm左右的长纸条，然后将已塞好棉花的移液管尖端放在长条报纸的一端，约成45℃角，折叠纸条包住尖端，用左手握住移液管身，有手将移液管压紧．在桌面上向前
搓转，以螺旋式包扎起来。上端剩余纸条，折叠打结，准备灭菌。
（二）液体及固体培养基的配制过程
1．液体培养基配制
（1）称量（假定配制1000ml培养基）
按培养基配方比例依次准确地称取3.0g牛肉膏、10.0 g蛋白胨、5.0gnacl放入烧杯（或1000ml刻度搪瓷杯）中．牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。
（2）溶化
在上述烧杯中先加入少于所需要的水量（如约700ml），用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，将药品完全溶解后，补充水到所需的总体积（1000ml）；如果配制固体培养基时，将称好的琼脂放人已溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。
（3）调ph
调ph：一般用ph试纸测定培养基的ph。用剪刀剪出一小段ph试纸，然后用镊子夹取此段ph试纸，在培养基中蘸一下，观看其ph范围，如培养基偏酸或偏碱时，可用1mol/l naoh或1mol/l hcl溶液进行调节。调节ph时，应逐滴加入naoh或hci溶液，防止局部过酸或过碱，破坏培养基中成分。边加边搅拌，并不时用ph试纸测试，直至ph达7.4-7.6。反之，用1mol／lhcl进行调节。
2．固体培养基的配制
配制固体培养基时，应将已配好的液体培养基加热煮沸，再将称好的琼脂(1.5~2％)加 入，并用玻棒不断搅拌，以免糊底烧焦。继续加热至琼脂全部融化，最后补足因蒸发而失去水分。
（三）培养基的分装
根据不同需要，可将已配好培养基分装入试管或三角瓶内，分装时注意不要使培养基沾污管口或瓶口，造成污染。如操作不小心，培养基沾污管口或瓶口时，可用镊子夹一小块脱脂棉，擦去管口或瓶口的培养基，并将脱脂棉弃去。
1．试管的分装
取一个玻璃漏斗，装在铁架上，漏斗下连一根橡皮管，橡皮管下端再与另一玻璃管相接，橡皮管的中部加一弹簧夹。分装时，用左手拿住空试管中部，并将漏斗下的玻璃管嘴插入试管内，以右手拇指及食指开放弹簧夹，中指及无名指夹佐玻璃管嘴，使培养基直接流入试管内。装入试管培养基的量视试管大小及需要而定，若所用试管大小为15×150 mm时，液体培养基可分装至试管高度1／4左有为宜；如分装固体或半固体培养基时，在琼脂完全融化后，应趁热分装于试管中。用于制作斜面的固体培养基的分装量为管高1／5(约3—4mi)，半固体培养基分装量为管高的1／3为宜。
2．三角瓶的分装
用于振荡培养微生物时，可在250 m1用于制作
平板培养基用时，可在250 m1三角瓶中加入150ml粉(按2％计算)，灭菌时瓶中琼脂粉同时被融化。
（四）棉塞的制作及试管、三角瓶的包扎
为了培养好气性微生物，需提供优良通气条件，同时为防止杂菌污染，则必须对通入试管或三角瓶内空气预先进行过滤除菌。通常方法是在试管及三角瓶口加上棉花塞等。
1．试管棉塞的制作
制棉塞时，应选用大小、厚薄适中的普通棉花一块，铺展于左手拇指和食指扣成的团孔上，用右手食指将棉花从中央压入团孔中制成棉塞．然后直接压入试管或三角瓶口。也可借用玻璃棒塞入，也可用折叠卷塞法制作棉塞。
制作的棉塞应紧贴管壁，不留缝隙，以防外界微生物沿缝隙侵入，棉塞不宜过紧或过松，塞好后以手提棉塞，试管不下落为准。棉塞的2／3在试管内，1／3在试管外。目前也有采用硅胶塞代替棉塞直接盖在试管口上。
将装好培养基并塞好棉塞或硅胶塞的试管捆成一捆，外面包上一层牛皮纸。用记号笔注明培养基名称及配制日期，灭菌待用。
2．三角瓶棉塞制作
通常在棉塞外包上一层纱布，再塞在瓶口上。有时为了进行液体振荡培养加大通气量，则可用8层纱布代替棉塞包在瓶口上，目前也有采用硅胶塞直接盖在瓶口上。
在装好培养基并塞好棉塞或包扎八层纱布或盖好硅胶塞的三角瓶口上，再包上一层牛皮纸并用线绳捆好，灭菌待用。
（五）培养基的灭菌
将上述培养基以0.103mpa，l21℃，20min高压蒸气灭菌。
灭菌过程：
1. 加水：首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面没过加热蛇
管，与三角搁架相平为宜。切勿忘记检查水位，加水量过少，灭菌锅会发生烧干引起炸裂事故。
2. 装料：放回内层锅，并装入待灭菌的物品。注意不要装得太挤，以免妨碍蒸
汽流通而影响灭菌效果。装有培养基的容器放置时要防止液体溢出，三角瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包扎的纸而透入棉塞。
3. 加盖：将盖上与排气孔相连的排气软管插入内层锅的排气槽内，摆正锅盖，
对齐螺口，然后以对称方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气，并打开排气阀。
4. 排气：打开电源加热灭菌锅，将水煮沸，使锅内的冷空气和水蒸汽一起从排
气孔中排出。一般认为当排出的气流很强并有嘘声时，表明锅内的空气已排尽，沸腾后约需5分钟。
5. 升压：冷空气完全排尽后，关闭排气阀，继续加热，锅内压力开始上升。
6. 保压：当压力表指针达到所需压力时，控制电源，开始计时并维持压力至所
需的时间。如本实验中采用0.1mpa，121.5℃，20分钟灭菌。
灭菌的主要因素是温度而不是压力，因此锅内的冷空气必须完全排尽后，才能关闭排气阀，维持所需压力。
7. 降压：达到灭菌所需的时间后，切断电源，让灭菌锅温度自然下降，当压力
表的压力降至“0”后，方可打开排气阀，排尽余下的蒸汽，旋松螺栓，打开锅盖，取出灭菌物品，倒掉锅内剩水。压力一定要降到“0”后，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基或试剂由于内外压力不平衡而冲出容器口，造成瓶口被污染，甚至灼伤操作者。
（六）斜面和平板的制作
1．斜面的制作
将已灭菌装有琼脂培养基的试管，趁热置于木棒或玻棒上，使成适当斜度，凝固后即成斜面。斜面长度不超过试管长度l／2为宜。如制作半团体或固体深层培养基时，灭菌后则应垂直放置至凝固。
2．平板的制作
将装在三角瓶或试管中已灭菌的琼脂培养基融化后，待冷至50℃左右倾入无菌培养皿中。温度过高时，皿盖上的冷凝水太多；温度低于50℃，培养基易于凝固而无法制作平板。
平板的制作应在火旁进行，左手拿培养皿，右手拿三角瓶的底部或试管，左手同时用小指和
手掌将棉塞打开，灼烧瓶口，用左手大拇指将培养皿盖打开一缝，至瓶口正好伸入，倾入10~15ml培养基，迅速盖好皿盖，置于桌上，轻轻旋转平皿，使培养基均匀分布于整个平皿中，冷凝后即成平板。
（七）培养基的灭菌检查
灭菌后的培养基，一般需进行无菌检查。最好取出1~2管(瓶)，置于37℃温箱中培养1~2天，确定无菌后方可使用。篇二：微生物实验报告
脓汁和粪便标本中病原菌的检测
专业： 学号： 姓名：
一、实验目的
探究检测其病原菌的类型并通过一系列的观察与鉴定从而确定其病原菌的名称和性质。在实践中学习培养基的制备、消毒和灭菌，细菌的分离与培养，细菌群体和个体形态特征的观察，细菌生化反应鉴定等技巧。从而掌握微生物实验的各种操作方法，培养对微生物实验的兴趣。
二、实验材料
器材
打火机、油性笔、酒精灯、接种环、接种针、污物盘、普通冰柜、隔水式电热恒温培养箱、奥林巴斯cx21型生物显微镜、电炉、试管（带棉塞）、称量纸、药勺、牛皮纸、硫酸纸、橡皮筋、尺子、锥形瓶、高压蒸汽灭菌器、镊子、玻片、吸水纸、拭镜纸
试剂药品
普通营养琼脂培养基、蒸馏水、脓汁标本、粪便标本、石蜡油、生理盐水、结晶紫、卢戈碘液、95%乙醇、稀释复红、葡萄糖微量发酵管（2支）、乳糖微量发酵管（2支）、青霉素抗菌素纸片、链霉素抗菌素纸片、庆大霉素抗菌素纸片、血浆、福氏志贺菌诊断血清
三、方法与步骤
干粉培养基→蒸馏水→加热溶化→分装→集中放在试管筐里→罩上硫酸纸、牛皮纸→ 用橡皮筋扎好 →放入讲台边的灭菌桶或灭菌筐内→送到高压蒸汽灭菌室（洗刷室）→灭菌→
（1）平板培养基：倾注平板10ml→琼脂完全凝固后，平板倒放→4℃冰箱保存备用。
（2）斜面培养基：培养基趁热斜放→琼脂凝固以后，4℃冰箱保存备用。→贴上标签后灭菌使用。
①空气的细菌学检查
每组1个营养琼脂平板，选择采样地点（实验室、卫生间或任选地点）→将平板盖打开，盖朝下放置在平板旁边→平板暴露于空气中15min→平板倒扣盖上→作标记→37℃温箱培养24h→观察结果。
②人体体表的细菌学检查
甲乙常规洗手，丙丁标准洗手。甲和乙、丙和丁共用1个平板
按规定在普通平板上接种手指上的细菌。第1格为洗手前，第2格为洗手后，第3格为消毒后，第4格空白对照。
接种环烧灼灭菌→分别取脓汁标本与粪便标本点在普通平板和依红美蓝平板上，各做两份，→烧掉接种环上多余的标本→冷却后，应用分区划线分离法，将脓汁标本接种于营养琼脂平板（2份），粪便标本接种于伊红美蓝平板（2份）→接种环烧灼灭菌→将平板倒置37℃培养18～24h→观察结果 。
接种环烧灼灭菌→挑选平板上典型的四种单菌落（白色、黄色、紫黑色、粉红色）进行斜面接种纯培养→做好标记→接种环烧灼灭菌→斜面培养基置于37℃培养过夜→保存备用 ①革兰氏染色：
取洁净载玻片→用灭菌操作后的接种环取生理盐水1-2环于玻片上→挑取细菌培养物少许与盐水轻轻抹匀→待涂片干燥后在酒精灯火焰外侧快速来回2-3回合→结晶紫初染1min→水洗
→卢戈碘液媒染1min→水洗→95％乙醇脱色约20s→水洗→稀释品红→复染1min→水洗→吸干,镜检。
②肉汤接种法:
接种环烧灼灭菌→分别在斜面培养物中挑取菌苔少许→立即移入肉汤培养基管中→在接近液面的管壁上轻轻研磨→沾取少量肉汤调和→混匀→试管口通过火焰2-3次灭菌→塞好棉塞→35℃培养4~6h
接种环烧灼灭菌→分别取之前实验中得到的四种菌液在普通平板密集涂布→接种环烧灼灭菌→ 标记:青、链、庆 →镊子火焰消毒→贴青霉素、链霉素、庆大霉素纸片→ 按压→镊子消毒→倒置37℃培养18～24h→ 观察结果取干净玻片一张→在左右两边分别滴加兔血浆1-2滴，生理盐水1滴→接种环烧灼灭菌→冷却→分别用接种环取之前实验所得到的白色和黄色菌苔(2～3个菌落的菌量)与血浆研磨混合→边混匀边观察结果→接种环烧灼灭菌→稍等片刻，观察结果
接种针烧灼灭菌→用灭菌接种针分别刮取实验所得到的紫黑色和粉红色菌苔→分别接种在葡萄糖发酵微量管中和乳糖发酵微量管内→接种环烧灼灭菌→将微量管平放在平板内→37℃培养过夜后→观察结果。
接种针烧灼灭菌→分别用接种针在紫黑色和粉红色的斜面取菌→从半固体培养基中心垂直刺入，可刺达近底管处，但不要到达管底→循原来的路线退出接种针→试管口迅速通过火焰2-3次灭菌→塞好棉塞→烧灼灭菌接种针→37℃培养24h→观察结果
取洁净的载玻片一张→将磨面近端设为对照区→滴加生理盐水15ul→远端设为试验区→滴加福氏志贺菌诊断血清15ul→接种环烧灼灭菌→用接种环分别取粉红色菌苔→研磨于盐水或血清内，混合均匀→接种环烧灼灭菌→载玻片来回倾侧→观察结果
四、结果与讨论对脓汁中细菌的分析讨论
1、用普通平板，从脓汁标本中分离出金黄色和白色两种菌落。
2、在显微镜下观察时，这两种细菌均为g+球菌，排列不规则，呈葡萄串状，是典型的葡萄球菌。
3、结合菌落的颜色，可以初步断定，这是金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌。
4、通过血浆凝固酶试验，观察到黄色菌落的细菌能使血浆产生颗粒性物质，说明为凝固酶阳性；白色菌落则没有凝集反应，说明其为凝固酶阴性。
5、最后进行的是药敏试验，从培养基上可以观察到，不同的抗生素所形成的抑菌圈不同。其中青霉素对金黄色葡萄球菌最敏感。
对粪便中细菌的分析讨论
1、用伊红美蓝平板分离菌落时，可以从粪便标本中分离出紫黑色具有金属光泽的菌落和粉红色半透明菌落。
2、在显微镜下观察时，这两种菌均为g-杆菌，排列不规则，从形态上不能鉴别是什么细菌。
3、经糖发酵试验，可以观察到，紫黑色的细菌能使葡萄糖和乳糖的试管变色和产生气体；粉红色的细菌只能使葡萄糖的试管变色。
4、经半固体动力试验，观察到紫黑色的细菌使半固体培养基成浑浊状态，粉红色的细菌只在接种针插入的方向聚集。
5、综上所述，紫黑色的细菌为大肠埃希菌，粉红色的细菌为志贺菌。
6、最后进行药敏试验时，发现大肠埃希菌对青霉素不敏感，对庆大霉素和链霉素都敏感。 综上所述，脓汁标本中分离得黄色菌落为金黄色葡萄球菌，白色菌落为白色葡萄球菌，致病菌为金黄色葡萄球菌；粪便标本中分离得紫黑色菌落为大肠埃希菌，粉红菌落为福氏志贺菌，致病菌为福氏志贺菌。篇三：微生物实验报告
动物微生物及免疫学实验报告
篇三：微生物实验报告一
北 方 民 族 大 学
学 生 实 验 报 告
院（部） 生物科学与工程学院 姓 名 学 号
专 业 生物工程 班 级
同组人员
课程名称 微生物学类实验实验名称 产酶微生物的分离、纯化与选育 实验日期2013.11批阅日期 成 绩 教师签字
北方民族大学教务处制
产酶微生物的分离、纯化与选育
实验意义：
酶是生物体内进行生物化学反应的催化剂，在生物体中已发现的酶有2500多种。由于酶促反应的特异性强，反应温和，安全无毒，环境污染少，在洗涤剂、皮革、纺织、诊断、制药等领域具有广泛的应用价值。能由工业生产的50多种酶制剂蛋白酶、淀粉酶等，大部分是由霉菌、细菌、链霉菌和酵母菌生产的。通过本实验，学会从自然界中分离产酶微生物的方法，军中的纯化技术及其高产菌的选育技术。
1. 蛋白酶产生菌的分离与纯化
1.1实验目的：学习从自然界中分离蛋白酶产生菌并纯化。
1.2实验原理
许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品（或其他样品）悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈作初筛。也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。
1.3实验仪器与材料
土壤样品或其他富含蛋白质的样品、牛肉膏蛋白胨培养基平板、酪蛋白平板、无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液；显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒等。
1.4实验方法与步骤
1.4.1配制酪素培养基：牛肉膏0.3g、NaCl 0.5g，酪素 1.0g，琼脂 2.0g，蒸馏水100mL左右， 调节pH 7.6-8.0。
1.4.1.1配制方法：称取酪素1g，先用少量2%NaOH润湿，玻璃棒搅动，再加适量的蒸馏水，在沸水浴中加热并搅拌，至完全溶解，补足水量至100mL，加入其他成分，调整pH值，灭菌备用。
1.4.2配制土壤样品：
1）采集土壤样品，用无菌水制备1：10土壤悬液。
2）取1：10土壤悬液5ml，然后将悬液按10、10、10、10梯度稀释，注入试管中。 -1-2-3-4
3）将这些试管放入75-80 ℃水浴中热处理10 min，以杀死非芽孢细菌。
1.4.3灭菌与接种：
1）将培养基灭菌处理。
2）取加热处理过的土壤悬液100-200 μL，涂布接种到酪素培养基平板，将平板倒置，于30-32 ℃培养24-48 h。
1.4.4.蛋白酶产生菌的纯化：
1）根据酪蛋白平板的水解圈作初筛，挑选出单菌落的蛋白酶产生菌。
2）将挑选出的单菌落用平板划线法接种到牛肉膏蛋白胨培养基上，然后将平板倒置放于培养箱中24—48h。
1.4.5芽孢杆菌的染色判断
1）挑去菌落涂片固定。
2）滴加1——2滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。
3）用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但勿沸腾，切忌使染液蒸干，必要时可添加少许染液
4）倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。
5）用番红水溶液复染1分钟，水洗至水为无色。
6）待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。
1.4.6蛋白酶产生菌的保存培养：
1）用斜面划线法，取纯化鉴定后的菌种接种于斜面上，放于培养箱中24—48h。
2）将培养后的菌种置于冰箱中保存。
1.5实验结果：
在含酪蛋白的平板上，产蛋白酶的芽孢杆菌可形成蛋白质水解圈。自然界中分离的微生物各菌株间产蛋白酶活力有很大差异，有些芽孢杆菌酶活力超过4000 U/mL。
1）描述你所分离的蛋白酶产生菌的菌落特征和个体形态特征；
答：第一组：A:原液培养基表面出现大面积菌落，难以挑出所需单一菌落；
B:10培养基表面菌落较多，但未发现与所需菌落相关特征；
C:10培养基表面基本未出现菌落：
D:10、10均发现与所需菌落特征相符的菌落，继续培养待进一步纯化。 第二组：A：原液培养基表面出现大面积菌落，难以区分 -2-3-4-1
B:10培养基表面基本未出现菌落
C:10培养基表面基本未出现菌落：
D:10、10培养基表面均发现与所需菌落特征相符的菌落，继续培养待进一步纯化
2）报告你所分离的蛋白酶产生菌的初筛（水解圈与菌苔直径的比值）结果。
答：求的平均HC值=1.7 -1-2-4-3
1.6注意事项
1）土壤悬液加热处理的温度和时间应准确控制；
2）点接含酪蛋白的平板时，接种量及接种面积要基本相同。
1.7分析与讨论
在酪蛋白平板上水解圈与菌落直径比值大的菌落，其蛋白酶活力不一定大，因此，对初筛选出的水解圈与菌落直径比值大的菌落要进行发酵培养，进一步对发酵液进行酶活力测定。
1.8思考题
1）对所筛选的菌株如何进一步提高酶活力？请写出设想和方案；
答：选用蛋白酶产量较高的原始菌种，扩大培养后，采用低浓度的菌悬液，进行紫外线时间梯度照射，选取一个突变率较高，成活率也较高的时间，大批量的进行紫外照射诱变，然后在明胶固体培养基平板上筛选水解圈较大的菌株接种，培养后测定水解酶活性，进一步筛选出高产菌株。
2）蛋白酶有哪些方面的应用。
答：蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。微生物蛋白酶，主要由霉菌、细菌，其次由酵母、放线菌生产。
2.产酶微生物菌种的选育
生物的遗传信息的改变是通过基因突变、基因重组和基因转移来进行的。基因突变，又称点突变（point mutation），包括自发突变和诱发突变，前者是未经人为施加诱变剂处理而发生的突变，后者是经人为施加诱变剂处理而获得的突变。两种突变都是由于一个或几个碱基的增加、缺失或置换而引起的，因此本质相同，不同的只是诱发突变的频率比自发突变的频率要高得多。这一部分的实验是以紫外线为例介绍了物理因素对微生物的诱变作用。本实验中，学生将筛选出的蛋白酶的产生菌株作为出发菌株通过紫外线即物理因素对微生物的诱变作用，对以上菌株进行选育工作。特以蛋白酶产生菌株作为出发菌株，经过紫外线的
诱变作用，根据透明圈直径与菌落直径的比值，可初步确定蛋白酶的高产菌株为例来介绍本实验内容。
2.1 实验目的 通过实验观察紫外线和亚硝基胍等理化因素对微生物的诱变效应，并掌握基本方法。
2.2 实验原理
基因突变可分为自发突变和诱发突变。许多物理因素、化学因素和生物因素对微生物都有诱变作用，这些能使突变率提高到自发突变水平以上的因素称为诱变剂。
紫外线（UV）是一种最常用的物理诱变因素。它的主要作用是使DNA双链之间或同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶间形成二聚体，阻碍双链的分开、复制和碱基的正常配对，从而引起突变。紫外线照射引起的DNA损伤，可由光复活酶的作用进行修复，使胸腺嘧啶二聚体解开恢复原状。因此，为了避免光复活，用紫外线照射处理以及处理后的操作应在红光下进行，并且照射处理后的微生物放在暗处培养。
本实验分别以紫外线作为单因子诱变剂处理产生蛋白酶的菌株，根据试验菌诱变后在蛋白酶培养基上透明圈直径的大小来指示诱变效应。一般来说，透明圈越大，蛋白酶活性越强。
2.3 实验仪器与材料
筛选出的蛋白酶的产生菌株、酪素培养基、无菌生理盐水、无菌水试管等；1 mL无菌吸管、玻璃涂棒、血细胞计数板、显微镜、紫外线等（15W）、磁力搅拌器、台式离心机、震荡混合器等。
2.4 实验方法与步骤
1）菌悬液的制备：① 取培养48小时生长旺盛的出发菌株斜面4-5支，用10 ml 无菌生理盐水将菌苔洗下，倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡30分钟，以打碎菌块。②用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升10个。
2）平板制作：将酪素培养基溶化后，冷至55℃左右时倒平板18套，凝固后待用。 8
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